1　范围                                                                                        

本标准规定了微生物肥料生产用菌种安全性分级目录、不同菌种及产品选择毒理学试验的原则、程序、试验方法和结果评价方法。

本标准适用于中华人民共和国境内生产、销售的微生物肥料。

2　规范性引用文件                                                                                        

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB 15193.3 食品安全国家标准 急性经口毒性试验

3　术语和定义                                                                                        

下列术语和定义适用于本文件。

3.1　急性经口毒性 acute oral toxicity                                                                                        

一次或在24h内多次经口给予实验动物受试物后，动物在短期内出现的毒性效应。

3.2　半数致死量 median lethal dose (LD50)                                                                                        

经口一次或24h内多次给予受试物后，能够引起动物死亡率为50%的受试物剂量，该剂量为经过统计得出的计算值。其单位是每千克体重所摄入受试物质的毫克数或克数，即mg/kg体重或g/kg体重。

4　选择毒理学试验的原则

4.1　生产用菌种

4.1.1　总则

微生物肥料生产用菌种分为四级管理，其安全分级目录见附录A，自主分离获得菌种应经专业权威机构鉴定。未列入附录A中的菌种，除根瘤菌和乳杆菌(Lactobacillus）外，其余均需做毒理学试验。所有生产用菌种均需要做溶血试验，植物病原菌不可用作生产菌种。采用生物工程菌，应具有允许大面积释放的生物安全性有关批文。                          

4.1.1.1  第一级（A.1）为免作毒理学试验的菌种。

4.1.1.2  第二级（A.2）为需做急性经口毒性试验的菌种。

4.1.1.3  第三级（A.3）为需做致病性试验的菌种。

4.1.1.4  第四级（A.4）为禁用菌种。

4.2  产品                                                                                        

4.2.1  除有机物料腐熟剂以外的固体微生物接种剂类产品均免做毒理学试验。

4.2.2  复合微生物肥料、生物有机肥和液体剂型微生物接种剂等需做急性经口毒性试验。

5　毒理学试验程序                                                                                        

5.1  菌种毒理学试验程序                                                                                        

5.1.1　应提供微生物肥料生产用菌种的鉴定资料，包括属及种的拉丁文学名和中文译名、形态、生理生化特性及鉴定依据、功能评价等资料。

5.1.2　根据产品所含菌种的鉴定资料，依据附录A之规定，确定菌种安全级别、是否做毒理学试验及毒理学检测项目。

5.1.3　对于需要做毒理学试验的菌种，生产者需提供试验用纯菌种斜面，经复核确认与该菌种鉴定资料相符且无杂菌污染后，进行毒理学试验。

5.2  产品毒理学程序                                                                                        

需对送检产品进行质量检测和载体物料的真实性确认后，进行毒理学试验。

6　试验方法                                                                                        

6.1 受试物的准备                                                                                        

6.1.1  菌种受试物                                                                                        

将试验菌种接种于适宜的培养基中，在适宜的条件下培养一定时间，用生理盐水调整菌液浓度至2.0×108                                                                               cfu/mL～2.0×109cfu/mL，该溶液为菌种受试物。

6.1.2  产品受试物                                                                                        

固体产品根据试验要求，配制所需浓度，溶剂首选去离子水，也可选用羧甲基纤维素、明胶、淀粉等。液体产品不可稀释，直接使用。

6.2  急性经口毒性试验                                                                                        

按GB 15193.3执行。

6.3  致病性试验项目                                                                                        

6.3.1  急性经口毒性试验                                                                                        

按GB 15193.3执行。

6.3.2  一次破损皮肤刺激试验                                                                                        

6.3.2.1  目的                                                                                        

检测受试物对实验动物皮肤的刺激/腐蚀作用和强度。

6.3.2.2  实验动物                                                                                        

每次实验至少需要3只皮肤完好的白色健康家兔或豚鼠。

6.3.2.3  操作程序                                                                                        

a)涂受试物前，将实验动物背部脊柱两侧的毛去掉，去毛范围约2.5cm×2.5cm，用75%酒精清洁、消毒暴露皮肤，待酒精挥发后，用灭菌刀片或注射针头分别在两块皮区内划一个“＃”形的破损伤口。注意皮肤破损仅达表皮，不要伤及真皮。

ｂ）将受试物0.5mL直接滴于破损皮肤上，或滴于同样大小的2层～4层纱布上并敷贴于破损皮肤表面，然后用一层无刺激塑料膜或油纸覆盖，再用无刺激胶布固定。另一侧去毛破损皮肤作为空白对照（或溶剂对照），敷贴时间为4h。试验结束后，用温水或无刺激性溶剂除去残留受试物。

ｃ）分别于去除受试物后1h、24h和48h观察皮肤局部反应，并按表1进行刺激反应评分。注意鉴别感染和原发性刺激反应的区别，若有感染可疑，应进行重复测试。

6.3.2.4  评价规定                                                                                        

在各个观察时间点，按照表1对动物的皮肤红斑与水肿形成情况进行评分，并按时间点将3只动物的评分相加，除以动物数，获得不同时间点的皮肤刺激反应积分均值（刺激指数）。取其中最高皮肤刺激指数，按表2评定该受试物对动物皮肤刺激强度的级别。

表1  皮肤刺激反应的评分标准 

皮肤刺激反应	皮肤刺激反应评分
红斑形成：
无	0
勉强可见	1
明显红斑	2
中等～严重红斑	3
紫红色红斑并有焦痂形成	4
水肿形成：
无	0
勉强可见	1
皮肤隆起，轮廓清楚	2
水肿隆起约1mm	3
水肿隆起超过1mm	4

表2  皮肤刺激强度分级

皮肤刺激指数	刺激强度级别
0～＜0.5	无刺激性
0.5～＜2.0	轻刺激性
2.0～＜6.0	中等刺激性
6.0～8.0	强刺激性

6.3.3    溶血试验                                                                                        

6.3.3.1  目的                                                                                        

检测受试物是否具有溶血特性。

6.3.3.2  操作程序                                                                                        

用无菌棉拭子蘸取菌种受试物，以蛇形线接种于血琼脂平板，置36℃±1℃培养箱中培养，24h±2h后观察有无溶血环产生。同时用已知阳性菌株金黄色葡萄球菌ATCC6538、蜡样芽孢杆菌CMCC(B)63303等作为质控菌株。

6.3.3.3  试验结果                                                                                        

菌落周围有β溶血环或α溶血环的，则溶血试验阳性；否则为阴性。

6.3.4  抗菌药物敏感试验                                                                                        

6.3.4.1  目的                                                                                        

检测受试物对抗菌药物的敏感性强度。

6.3.4.2  试验用抗菌药物                                                                                        

可选用头孢哌酮（CFP）、四环素（TE）、头孢唑啉（CZ）、链霉素（S）、痢特灵（FR）、环丙沙星（CIP）、复方新诺明（SXT）、氯霉素（C）、氨苄青霉素（AM）、庆大霉素（GM）、强力霉素（DO）、丁胺卡那霉素（AN）、甲氟哌酸（PEF）、氟啶酸（ENO）、多西环素（DO）、依诺沙星（ENO）、阿米卡星（AN）、黄连素（ Berberine  Hydrochloride）、两性霉素B（Amphotericin   B）、伊曲康唑（Itraconazole）等抗菌药物。

6.3.4.3  操作程序                                                                                        

ａ）用无菌棉拭子将受试物均匀涂抹于营养琼脂平板表面，共3次。每涂抹1次，平板应转动60º，最后将棉拭子绕平板边缘涂抹1周。盖好平皿，置室温干燥5min。

ｂ）用无菌棉拭子蘸取浓度为2.0×108cfu/mL～2.0×109cfu/mL质控菌株菌悬液，均匀涂抹于营养琼脂平板表面，具体方法同上，作为对照试验。

ｃ）以无菌操作取出抗菌药物纸片分别贴在涂有受试物和质控菌株菌悬液的平板培养基表面，每个平板放4个纸片。然后将平板置于36℃±1℃恒温培养箱中培养18h后观察抗菌药物纸片周围有无抑菌环，量取并记录其直径（包括纸片直径）大小，单位mm。试验应做3个平行，取其均值。

d）质控菌抑菌环应均在质控范围内，说明试验方法准确可靠，否则试验无效。质控菌株可选用大肠埃希氏菌ATCC25922等标准菌株。

6.3.5  急性腹腔注射致病性试验                                                                                        

6.3.5.1  目的                                                                                        

检测受试物的急性致病性。

6.3.5.2  试验动物                                                                                        

清洁级健康成年昆明小鼠（Kunming mice）或BALB/c小鼠（BALB/c mice）。

6.3.5.3  操作程序                                                                                        

a）选健康成年小鼠40只，体重18g～20g，雌、雄各半，剂量为500mg/kgBW，按0.1mL/10gBW经腹腔注射受试物。

b）于腹腔注射后第3d、7d分别取存活的实验动物雌、雄各5只解剖，并做大体病理学观察。

c)   腹腔注射后第14d将剩余实验动物处死、解剖并做大体病理学观察。

6.3.5.4  结果观察、评价                                                                                        

根据试验周期内动物有无死亡及出现的中毒体症、大体病理学观察及病理组织学检查发现病变的程度进行分级判定（见表3）。

表3 急性致病性判定标准 

级  别	判定依据
强致病性	动物出现死亡，死亡动物及24h以上存活动物在第3d、7d经解剖肉眼检查和病理组织学检查即可发现脏器的明显病变。
弱致病性	动物有中毒体症无死亡，动物第14d经解剖肉眼检查和病理组织学检查可发现脏器的明显病变。
无致病性	动物无中毒体症无死亡，动物第14d解剖肉眼检查和病理组织学检查均未发现脏器的明显病变。

6.3.6 急性眼刺激试验                                                                                        

6.3.6.1   目的

检测受试物对实验动物眼睛的急性刺激和腐蚀作用。

6.3.6.2  实验动物

新西兰家兔3只，体重1000g~1500g，试验前检查家兔双眼，有异常者不能用于试验。

6.3.6.3  操作程序

a）吸取受试物0.1mL，滴入家兔一侧眼结膜囊内，另一侧眼以生理盐水作为正常对照。

b）滴受试物后，将眼被动闭合4s，30s后用生理盐水冲洗。于滴眼后1h、24h、48h、72h、7d、14d和21d，肉眼观察家兔眼结膜、虹膜和角膜的损伤与恢复情况。如果72h内未出现刺激反应，或第7d或第14d，眼睛刺激反应完全恢复，即可提前终止试验。必要时，用2%荧光素钠溶液或裂隙灯、放大镜检查角膜及虹膜变化。

6.3.6.4  评价规定

按表4对家兔眼角膜、虹膜和结膜的急性刺激反应进行评分，并分别计算每只动物在3个不同观察时间（24h、48h和72h）角膜损害、虹膜损害、结膜充血和结膜水肿四方面的“平均评分”（即每只动物的24h、48h和72h评分之和除以观察数3）。分别以动物眼角膜、虹膜和结膜充血、水肿的平均评分和恢复时间进行评分，按表5或表6眼刺激反应分级标准判定受试物对眼睛的刺激强度。

表4  急性眼刺激反应的评分标准  

眼损害表现	评分
角膜损害： 无溃疡形成或混浊 散在或弥漫性混浊，虹膜清晰可见 半透明区易分辨，虹膜模糊不清 出现灰白色半透明区，虹膜细节不清，瞳孔大小勉强可见 角膜不透明，混浊，虹膜无法辨认	0 1 2 3 4
虹膜损害： 正常 皱褶明显加深，充血，肿胀，角膜周围有中度充血，瞳孔对光仍有反应 出血、肉眼可见破坏，或瞳孔对光无反应	0 1 2
结膜（睑结膜、球结膜）充血： 血管正常 血管充血呈鲜红色 血管充血呈深红色，血管不易分辨 弥漫性充血呈紫红色	0 1 2 3
结膜（睑结膜、球结膜）水肿： 无水肿 轻微水肿（包括瞬膜） 明显水肿，伴有部分眼睑外翻 水肿至眼睑近半闭合 水肿至眼睑大半闭合	0 1 2 3 4

  表5  眼刺激反应分级标准     

级  别		判定依据
可 逆 性 损 伤	无刺激性	3只动物的平均评分：角膜损害<1、虹膜损害<1、结膜充血<2和结膜水肿<2；或3只动物中至少有2只动物的平均评分符合上述标准，另外1只动物的刺激反应在21d内完全恢复。
	轻刺激性	3只动物中有2只动物的平均评分：角膜损害≥1；虹膜损害≥1；结膜充血≥2；结膜水肿≥2，且7d内全部动物的刺激反应完全恢复。
	刺激性a	3只动物中有2只动物的平均评分：角膜损害≥1；虹膜损害≥1；结膜充血≥2；结膜水肿≥2，且21d内全部动物的刺激反应完全恢复。
不可逆 性损伤	腐蚀性b	至少有1只动物的角膜、虹膜或结膜的刺激反应在21d的观察期内未完全恢复或/和在3只动物中有2只动物的平均评分：角膜损害≥3；虹膜损害≥1.5。
注：完全恢复是指动物的眼刺激反应评分：角膜损害=0，虹膜损害=0，结膜充血=0或1，结膜水肿=0或1。
a  接触受试物后所产生的可逆性炎性反应。 b  接触受试物后所产生的不可逆性组织损伤。

表6   眼刺激性反应分级标准    

平均评分	动物数（只）	恢复时间（d）a	损伤类型
角膜损害<1和 虹膜损害<1和 结膜充血<2和 结膜水肿<2	≥2	≤21	无刺激性
角膜损害≥1或 虹膜损害≥1或 结膜充血≥2或 结膜水肿≥2	≥2	≤7	轻刺激性
		≤21	刺激性
角膜损害≥3或 虹膜损害≥1.5	≥2		腐蚀性b
角膜损害≥1或 虹膜损害≥1或 结膜充血≥1或 结膜水肿≥1	≥1	>21
a  为动物刺激反应评分恢复至角膜损害=0，虹膜损害=0，结膜充血=0或1，结膜水肿=0或1的时间。 b  至少有1只动物于21d尚存在角膜粘连或血管翳，也可判为腐蚀性。

7　结果评价

7.1  总则                                                                                        

凡有毒或致病性试验结果不符合的菌种（株），均不得作为微生物肥料生产用菌种；毒理学试验结果评价为有毒的产品，不得生产和销售。

7.2  急性经口毒性试验                                                                                        

描述由中毒表现初步提示的毒作用特征，根据LD50值确定受试物的急性毒性分级（见附录B）。凡LD50>5000mg/kgBW的，可通过，即该菌种可作为生产用菌种或该产品可进行生产、销售。

7.3 致病性试验                                                                                        

7.3.1 急性经口毒性试验                                                                                        

结果判定同7.2。

7.3.2 一次破损皮肤刺激试验                                                                                        

如结果为无刺激或仅具轻度刺激作用，可通过；否则，应放弃使用。

7.3.3 溶血试验                                                                                        

溶血试验结果为阴性的，可通过；否则，应放弃使用。

7.3.4 抗菌药物敏感试验                                                                                        

受试菌株必须对两种以上的抗菌药物敏感；否则，应放弃使用。

7.3.5 急性腹腔注射致病性试验                                                                                        

结果为无急性致病性可通过；否则，应放弃使用。

7.3.6 急性眼刺激试验                                                                                        

结果对眼无刺激性或具有轻刺激性的，可通过；否则，应放弃使用。

　

附录A （规范性附录）
                                                                                            菌种安全分级目录                                                                                        

A.1  第一级：免作毒理学试验的菌种                                                                                        

A.1.1  根瘤菌类     

        

还包括尚未确定种名的，从一些豆科植物根瘤内分离、纯化、鉴定、回接、筛选后在原宿主植物结瘤、固氮良好的根瘤菌。                                                            

A.1.2  自生及联合固氮微生物类                                                          

A.1.3  光合细菌类

A.1.4  促生、分解磷钾化合物细菌类

A.1.5  乳酸菌类

                      

A.1.6  酵母菌类

A.1.7  AM 真菌类

 A.1.8  放线菌类      

Frankia sp.	弗兰克氏菌（固氮放线菌）
Streptomyces fradiae	弗氏链霉菌
Streptomyces microflavus	细黄链霉菌

A.2  第二级：需做急性经口毒性（LD50）试验的菌种

Arthrobacter arilaitensis	阿氏团队节杆菌（研究团队节杆菌）
Arthrobacter aurescens	变金黄节杆菌（金黄节杆菌）
Aspergillus candidus	亮白曲霉
Aspergillus chevalieri （Eurotium chevalieri)	谢瓦曲霉（谢瓦散囊菌）
Aspergillus japonicus	日本曲霉
Aspergillusniger	黑曲霉
Aspergillus oryzae	米曲霉
Aspergillus penicillioides	帚状曲霉
Aspergillus sydowii	聚多曲霉
Aspergillus wentii	温特曲霉
Bacillus atrophaeus	深褐芽孢杆菌（萎缩芽孢杆菌）
Bacillus circulans	环状芽孢杆菌
Brevundimonas vesicularis（Pseudomonas vesicularis）	泡囊短波单胞菌（泡囊假单胞菌）
Chaetomium  cochliodes	螺卷毛壳
Chaetomium globosum	球毛壳
Chaetomium trilaterale	三侧毛壳
Clonostachys rosea （Gliocladium roseum）	粉红螺旋聚孢霉；粉红枝穗霉（粉红粘帚霉）
Clostridium pasteurianum	巴斯德梭菌（巴氏梭菌）
Dipodascus geotrichum（Geotrichum candidum）	地丝双足囊菌（白地霉）
Hydrogenophaga flava	黄色食氢产水嗜菌（黄色嗜氢菌）
Laceyella sacchari	糖莱西氏菌（甘蔗兰希氏菌）
Lysinibacillus sphaericus（Bacillus sphaericus）	球形赖氨酸芽孢杆菌（球形芽孢杆菌）
Myceliophthora thermophila（Sporotrichum thermophie）	嗜热毁丝霉（嗜热侧孢霉）
Metarhizium anisopliae	金龟子绿僵菌
Paenibacillus macerans	浸麻类芽孢杆菌
Penicillium albicans	白色青霉
Penicillium bilaiae	拜赖青霉（比莱青霉）
Penicillium citreonigrum（Eupenicillium hirayamae）	黄暗青霉（平山正青霉）
Penicillium corylophilum	顶青霉
Penicillium expansum	扩展青霉
Penicillium glabrum（Penicillium frequentans）	光孢青霉（常现青霉）
Penicillium oxalicum	草酸青霉
Phanerodontia chrysosporium（Phanerochaete chrysosporium）	异原黄孢原毛平革菌（黄孢原毛平革菌）
Promicromonospora citrea	柠檬原小单胞菌
Pseudomonas fluorescens	荧光假单胞菌
Pseudomonas putida	恶臭假单胞菌
Pseudomonas stutzeri	施氏假单胞菌
Purpureocillium lilacinum（Paecilomyces lilacinus）	淡紫紫孢菌（淡紫拟青霉）
Rhizopus nigricans	黑根霉
Rhizopus oryzae	米根霉
Sphingobacterium multivorum（Flavobacterium multivorum)	多食鞘氨醇杆菌（多食黄杆菌）
Streptomyces albidoflavus	微白黄链霉菌
Streptomyces albogriseolus	白浅灰链霉菌
Streptomyces alboniger	白黑链霉菌
Streptomyces albovinaceus	白酒红链霉菌
Streptomyces albus	白色链霉菌
Streptomyces avermitilis	阿维菌素链霉菌（除虫链霉菌）
Streptomyces cellulosae	纤维素链霉菌
Streptomyces corchorusii	黄麻链霉菌
streptomyces globisporus	球孢链霉菌
Streptomyces griseoincarnatus	灰肉色链霉菌（灰肉红链霉菌）
Streptomyces hiroshimensis (Streptomyces salmonis )	广岛链霉菌（鲑色链霉菌）
Streptomyces lavendulae	淡紫灰链霉菌
Streptomyces pactum	密旋链霉菌
Streptomyces rochei	娄彻链霉菌
Streptomyces tendae	唐德链霉菌
Streptomyces thermoviolaceus	热紫链霉菌
Streptomyces venezuelae	委内瑞拉链霉菌
Streptomyces vinaceusdrappus	酒红土褐链霉菌
Streptomyces caelestis	天青链霉菌
Stretomyces canus	暗灰链霉菌
Stretomyces costaricanus	哥斯达黎加链霉菌
Trichoderma asperellum	棘孢木霉
Trichoderma atroviride	深绿木霉
Trichoderma ghanense	加纳木霉
Trichoderma harzianum	哈茨木霉
Trichoderma koningii	康宁木霉
Trichoderma longibrachiatum	长枝木霉
Trichoderma pseudokoningii	拟康宁木霉
Trichoderma reesei	里氏木霉
Trichoderma virens	绿木霉
Trichoderma viride	绿色木霉

A.3  第三级：需做致病性试验的菌种

Achromobacter denitrificans（Alcaligenes denitrificans）	反硝化无色小杆菌（反硝化产碱菌）
Achromobacter xylosoxidans（Alcaligenes xylosoxidans）	木糖氧化无色小杆菌（木糖氧化产碱菌）
Acinetobacter baumannii	鲍氏不动杆菌
Acinetobacter calcoaceticus	乙酸钙不动杆菌
Alcaligenes faecalis	粪产碱菌
Bacillus cereus	蜡样芽孢杆菌
Brevundimonas diminuta（Pseudomonas diminuta)	缺陷短波单胞菌（缺陷假单胞菌、微小假单胞菌)
Burkholderia fungorum	真菌伯克霍尔德氏菌
Enterobacter cloacae	阴沟肠杆菌
Enterobacter gergoviae	日勾维肠杆菌
Gordonia amarae（Nocardia amarae）	沟戈登氏菌，污泥戈登氏菌（沟诺卡氏菌）
Mucor circinelloides	卷枝毛霉
Nocardia sp.	诺卡氏菌
Nocardiopsis sp.	拟诺卡氏菌
Pantoea agglomerans（Enterobacter agglomerans）	成团泛菌（成团肠杆菌）
Pseudomonas alcaligenes	产碱假单胞菌
Rhizobium radiobacter（Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium tumefaciens)	放射杆状根瘤菌（放射形农杆菌，根癌农杆菌）
Proteus sp.	变形菌

A.4  第四级：禁用菌种

Alternaria sp.	链格孢属
Aspergillus flavus	黄曲霉
Aspergillus fumigatus	烟曲霉
Aspergillus nidulans	构巣曲霉
Aspergillus ochraceus	赭曲霉
Aspergillus parasiticus	寄生曲霉
Aspergillus rugulosus	细皱曲霉
Aspergillus versicolor	杂色曲霉
Bacillus anthracis	炭疽芽孢杆菌
Candida parapsilosis	近平滑假丝酵母
Candida tropicalis	热带假丝酵母
Claviceps sp.	麦角菌
Erwinia sp.	欧文氏菌
Fusarium sp.	镰孢菌（镰刀菌）
Klebsiella oxytoca	产酸克雷伯氏菌
Klebsiella pneumoniae	肺炎克雷伯氏菌
Penicillium chrysogenum	产黄青霉
Penicillium citrinum	桔青霉
Penicillium cyclopium	圆弧青霉
penicillium marneffei	马尔尼菲青霉
Penicillium viridicatum	鲜绿青霉
Pseudomonas aeruginosa	铜绿假单胞菌
Pseudomonas marginalis	边缘假单胞菌
Ralstonia solanacearum （Pseudomonas solanacearum）	茄科罗尔斯通氏菌 （茄科假单胞菌、青枯假单胞菌）
Pseudomonas syringae	丁香假单胞菌

附 录 B

（规范性附录）

急性毒性（LD50）剂量分级

B.1 急性毒性（LD50）剂量分级

急性毒性（LD50）剂量分级见表B.1

表B.1 急性毒性（LD50）剂量分级表

级别	大（小）鼠口服LD50/ （mg/kg体重）	相当于人的致死量
		mg/kg体重	g/人
极毒	＜1	稍尝	0.05
剧毒	1～50	500～4 000	0.5
中等毒	51～500	4 000～30 000	5
低毒	501～5 000	30 000～250 000	50
实际无毒	＞5 000	250 000～500 000	500